Um zu verstehen, welche Funktionen RNA im Detail erfüllt, haben Forscher der Universität Heidelberg und des Karlsruher Instituts für Technologie (KIT) ein neues Verfahren der Fluoreszenzbildgebung entwickelt. Dank es molekularen Marker RhoBAST lässt sich RNA in lebenden Zellen mit bisher unerreichter Auflösung darstellen.
Das Verfahren stützt sich auf einen neuartigen molekularen Marker mit dem Namen Rhodamine-Binding Aptamer for Super-Resolution Imaging Techniques (RhoBAST). Dieser RNA-basierte Fluoreszenzmarker wird in Verbindung mit dem Farbstoff Rhodamin eingesetzt.
Marker und Farbstoff treten aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften in eine spezielle Wechselwirkung, wodurch einzelne RNA-Moleküle zum Leuchten gebracht werden. Mithilfe der Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie, die zu den bildgebenden Verfahren mit höchster Auflösung gehört, können sie anschließend sichtbar gemacht werden. Da es bislang an geeigneten Werkzeugen zur gezielten Fluoreszenzmarkierung mangelte, war die direkte Beobachtung von Ribonukleinsäuren mittels optischer Fluoreszenzmikroskopie nur eingeschränkt möglich.
RhoBAST bringt den zelldurchlässigen Rhodamin-Farbstoff zum Leuchten
RhoBAST wurde von Wissenschaftlern des Instituts für Pharmazie und Molekulare Biotechnologie (IPMB) der Universität Heidelberg und des Instituts für Angewandte Physik (APH) des KIT entwickelt. Der von ihnen geschaffene Marker ist genetisch kodierbar und kann somit an das Gen einer beliebigen, von einer Zelle produzierten RNA andocken.
RhoBAST selbst ist nicht fluoreszent, bringt jedoch den zelldurchlässigen Rhodamin-Farbstoff zum Leuchten, indem es diesen spezifisch bindet.
Dies hat eine dramatische Fluoreszenzsteigerung des RhoBAST-Farbstoffkomplexes zur Folge. Sie ist eine wichtige Voraussetzung, um exzellente Fluoreszenzbilder zu erhalten. Für die RNA-Bildgebung mit höchster Auflösung benötigt der Marker jedoch zusätzliche Eigenschaften.
Dr. Murat Sünbül, IPMB
Die Forscher fanden heraus, dass ein Rhodamin-Farbstoffmolekül nur etwa eine Sekunde lang an RhoBAST bindet, bevor es sich wieder löst. Dieser Vorgang wiederholt sich anschließend innerhalb weniger Sekunden mit einem neuen Farbstoffmolekül.
„Starke Wechselwirkungen wie zwischen RhoBAST und Rhodamin, kombiniert mit einer außergewöhnlich schnellen Austauschkinetik, sind eher selten“, sagt Prof. Dr. Gerd Ulrich Nienhaus vom APH. Da Rhodamin erst nach der Bindung an RhoBAST fluoresziert, kommt es durch die ständig neu entstehenden Verbindungen zwischen Marker und Farbstoff zu einem unaufhörlichen „Blinken“. „Dieses An-Ausschalten ist genau das, was wir für die Bildgebung mit der Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie brauchen“, so Prof. Nienhaus.
RNA-Marker mit hervorragenden Eigenschaften
Dabei löst das RhoBAST-System ein weiteres wichtiges Problem: Fluoreszenzbilder werden unter Bestrahlung mit Laserlicht aufgenommen, was die Farbstoffmoleküle mit der Zeit zerstört. Der schnelle Farbstoffaustausch sorgt dafür, dass gebleichte Farbstoffe durch frische ersetzt werden. Somit können einzelne RNA-Moleküle länger beobachtet werden, was die Bildauflösung stark verbessern kann, wie Prof. Dr. Andres Jäschke, Wissenschaftler am IPMB, erläutert.
Dass RhoBAST als RNA-Marker hervorragende Eigenschaften besitzt, konnten die Wissenschaftler aus Heidelberg und Karlsruhe mit der Visualisierung von RNA-Strukturen im Inneren von Darmbakterien (Escherichia coli) und menschlichen Zellen in Kultur mit exzellenter Lokalisierungsgenauigkeit demonstrieren.
Wir können Details der bislang unsichtbaren subzellulären Strukturen und molekularen Interaktionen unter Beteiligung von RNA mithilfe von höchstauflösender Fluoreszenzbildgebung sichtbar machen. Dies wird ein grundlegend neues Verständnis biologischer Prozesse ermöglichen.
Prof. Dr. Andres Jäschke, IPMB
Die Forschungsarbeiten von Murat Sünbül und Andres Jäschke im Rahmen der Studie wurden von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt, die Arbeit von Gerd Ulrich Nienhaus von der DFG und der Helmholtz-Gemeinschaft. Die Forschungsergebnisse wurden in der Fachzeitschrift „Nature Biotechnology“ veröffentlicht.