An der LMU gelang es, mittels pMINFLUX multiplexing schnelle dynamische Prozesse zwischen Molekülen auf der molekularen Ebene zu verfolgen. Neben der Lokalisierung der Farbstoffe ermöglicht die Methode Einblicke in eine grundlegende Eigenschaft der Fluoreszenzfarbstoffe: ihre Fluoreszenzlebensdauer.
Abläufe in unserem Körper sind durch das Zusammenspiel verschiedener Biomoleküle, wie etwa von Proteinen und DNA, geprägt. Diese Prozesse finden in einem Bereich von oft nur wenigen Nanometern statt. Sie lassen sich somit mit Fluoreszenzmikroskopie nicht mehr beobachten, deren Auflösungsgrenze aufgrund der Lichtbeugung bei etwa 200 Nanometern liegt. Befinden sich zwei Farbstoffe, mit denen man Biomoleküle markiert, näher zusammen als diese optische Grenze, kann man ihre Fluoreszenz unter dem Mikroskop nicht mehr unterscheiden. Da diese jedoch zur Lokalisierung der Farbstoffe herangezogen wird, ist eine korrekte Positionsbestimmung unmöglich.
Klassischerweise wird die Auflösungsgrenze in super-auflösenden Mikroskopiemethoden umgangen, indem man die Farbstoffe zum Blinken bringt und ihre Fluoreszenz wortwörtlich an- und wieder ausschaltet. So wird die Fluoreszenz zeitlich getrennt und damit unterscheidbar, was Lokalisationen unterhalb der klassischen Auflösungsgrenze ermöglicht. Für Anwendungen, in denen schnelle dynamische Prozesse untersucht werden, hat dieser Trick jedoch einen entscheidenden Nachteil: Das Blinken sorgt dafür, dass mehrere Farbstoffe nicht gleichzeitig lokalisiert werden können. Das verschlechtert die zeitliche Auflösung bei der Untersuchung dynamischer Prozesse, die unter Beteiligung mehrerer Biomoleküle stattfinden, erheblich.
Innovative Methode: pMINFLUX multiplexing
Unter der Leitung von LMU-Chemiker Professor Philip Tinnefeld und in Kooperation mit Professor Fernando Stefani (Buenos Aires) haben Forschende der LMU mittels pMINFLUX multiplexing nun einen eleganten Ansatz entwickelt, um dieses Problem zu lösen. Die Methode wurde kürzlich im Fachmagazin Nature Photonics veröffentlicht. MINFLUX ist eine super-auflösende Mikroskopiemethode, die Lokalisationen mit Präzisionen von nur einem Nanometer ermöglicht. Im Gegensatz zu konventionellem MINFLUX registriert pMINFLUX die Zeitdifferenz zwischen der Anregung der Farbstoffe mit einem Laserpuls und der daraus folgenden Fluoreszenz in Sub-Nanosekunden-Auflösung. Das ermöglicht neben ihrer Lokalisation Einblicke in eine grundlegende Eigenschaft der Fluoreszenzfarbstoffe: ihre Fluoreszenzlebensdauer. Diese beschreibt, wie lange es im Schnitt dauert, bis ein Farbstoffmolekül nach seiner Anregung fluoresziert.
Neue Erkenntnisse über Proteininteraktionen und andere biologische Phänomene
„Die Fluoreszenzlebensdauer hängt vom verwendeten Farbstoff ab“, erklärt Fiona Cole, Erstautorin der Publikation. „Wir haben Unterschiede in der Fluoreszenzlebensdauer bei Verwendung verschiedener Farbstoffe genutzt, um die Fluoreszenz den unterschiedlichen Farbstoffmolekülen zuzuordnen, ohne dass ein Blinken und eine damit verbundene zeitliche Trennung nötig ist“. Die Forschenden adaptierten hierfür den Lokalisierungsalgorithmus und bauten ein multiexponentielles Fit-Model ein, um die gewünschte Auftrennung zu erreichen.
„Das hat uns erlaubt, die Position mehrerer Farbstoffe gleichzeitig zu bestimmen und so schnelle dynamische Prozesse zwischen mehreren Molekülen mit nanometergenauen Präzisionen zu untersuchen“, fügt Jonas Zähringer, ebenfalls Erstautor, hinzu. Die Forschenden demonstrierten ihre Methode durch das genaue Tracken zweier DNA-Stränge während des Wechsels zwischen verschiedenen Positionen auf einer DNA-Origami-Nanostruktur, die Auftrennung von Translations- und Rotationsbewegungen einer DNA-Origami-Nanostruktur und die Messung des Abstandes zwischen den Antigen-Anbindestellen von Antikörpern. „Das ist jedoch erst der Anfang“, so Philip Tinnefeld. „Ich bin mir sicher, dass pMINFLUX multiplexing mit seiner hohen zeitlichen und räumlichen Auflösung in Zukunft neue Erkenntnisse über Proteininteraktionen und andere biologische Phänomene liefern wird.“
Originalpublikation:
Fiona Cole, Jonas Zähringer, Johann Bohlen, Tim Schröder, Florian Steiner, Martina Pfeiffer, Patrick Schüler, Fernando D. Stefani & Philip Tinnefeld: Super-resolved FRET and co-tracking in pMINFLUX. Nature Photonics 2024
https://doi.org/10.1038/s41566-024-01384-4